УДК 632.937.16

ЗАТРАТЫ И ОСОБЕННОСТИ ПОЛУЧЕНИЯ ИСХОДНОГО СУХОГО БИОМАТЕРИАЛА ДЛЯ НАРАБОТКИ ЭТАЛОНА ВИРУСНОГО ПРЕПАРАТА ПРОТИВ РЫЖЕГО СОСНОВОГО ПИЛИЛЬЩИКА

 

THE COST TO OBTAIN A SOURCE OF DRY BIOLOGICAL MATERIAL FOR DEVELOPMENT OF STANDARD VIRAL DRUG AGAINST SAWFLY

 

Чеплянский И.Я., Латышова Н.С. (филиал ФБУ ВНИИЛМ «Южно-европейская НИЛОС», ст. Вешенская, Шолоховский р-н, Ростовская обл., РФ)

Алпацкая Ю.И. (ФБУ ВНИИЛМ, г. Пушкино, Московская обл., РФ)

 

CheplyanskyI. J., Latyshova N. S. (a branch of the FBU VNIILM "South European NILOS" the village of Veshenskaya, Sholokhov district, Rostov region, Russia)

Alpacka Y. I. (VNIILM, Pushkino, Moscow region, Russia)

 

Рассмотрены вопросы получения сухого исходного биоматериала для производства эталона вирусного препарата  против рыжего соснового пилильщика, даны  затраты выполняемых видов работ по каждой операции 

 

Ключевые слова: рыжий сосновый пилильщик, биологические средства защиты, ядерный полиэдроз, эталон вирусного препарата,  вирусная биомасса.

Keywords : pine Sawfly, biological protection, nuclear poliedros, the standard viral preparation, viral biomass.
 

Рыжий сосновый пилильщик широко распространен в границах произрастания сосны,  по всей европейской части территории России и в Сибири  до Тихого океана, нанося огромный вред сосновым лесам. Вспышки размножения этого вредителя возникают как в естественных, так и в искусственных насаждениях, нередко приводя к гибели молодые культуры. Борьба с данным фитофагом ведется на протяжении многих лет. Основным методом защиты, сдерживающим вспышки размножения вредителя в нашей стране, являются химические инсектициды. К преимуществам данного метода лесозащиты можно отнести широкий спектр и высокую результативность действия данных препаратов, но существенным недостатком, все же, остается высокая степень опасности для окружающей среды, животных и птиц. Следует отметить также то, что не везде возможно применять химические средства борьбы с вредителями, например, в водоохранных зонах использование химических инсектицидов запрещено законодательством РФ (Статья 104 Лесной кодекс РФ). В отличие от химических препаратов, биологические средства защиты, в частности, препараты созданные на основе бакуловирусов, не представляют опасности для лесных биогеоценозов. Преимущество данных препаратов состоит в том, что они обладают высокой видоспецифичностью, т.е. действуют исключительно на рыжего соснового пилильщика, не причиняя вреда окружающей среде.

Из литературных данных зарубежных и отечественных исследователей известно, что впервые вирусы были открыты  российским ученым Д.И. Ивановским при изучении мозаичной болезни табака в 1892 году. В 1913 году К. Эшерихом был выявлен полиэдроз рыжего соснового пилильщика[1]. В Советском Союзе, в 1954 году О.И. Швецова одна из первых обратила внимание на необходимость применения вирусных болезней в борьбе с рыжим сосновым пилильщиком.  Начиная с 70-х годов прошлого века и вплоть до 2009 г. в нашей стране широко применялся отечественный препарат «Вирин–Диприон», созданный на основе вируса ядерного полиэдроза. Ядерный полиэдроз– один из самых эффективных факторов смертности рыжего соснового пилильщика, вследствие строения вируса, хорошо сохраняющийся в природе,  поражающий насекомых на любой фазе развития, но наиболее эффективно, приводя к гибели,  в личиночной. По данным Н.В. Бондаренко [2] данный вирус относится к семейству бакуловирусов  или палочковидных вирусов (Baculoviridae). Вирус очень устойчив к воздействию внешних факторов окружающей среды, по данным исследований Е.В. Орловской [3]спустя 5 лет после обработки 25% вирусного препарата сохраняется в почве, препарат не смывается пятичасовым дождеванием. Под воздействием солнечных лучей вирус, находящийся в клетках погибших насекомых, не инактивируется. Исследования вируса ядерного полиэдроза показали, что его развитие происходит в эпителии среднего отдела кишечника рыжего соснового пилильщика [2,4,5]. По данным Ю.В. Максимовой [5] симптомы заражения ядерным полиэдрозом кишечного типа очень заметны: прекращается питание, ложногусеницы становятся менее активными. Нередко изо рта и ануса вытекает жидкость, содержащая большое количество полиэдров, заражающих здоровых личинок. Так как рыжий сосновый пилильщик живет колониями, заражение ложногусениц  происходит очень быстро.Поэтому применение вирусных препаратов для борьбы со вспышками размножения данного фитофага остается наиболее эффективным средством  и на сегодняшний день.

Вследствие того, что производство препарата «Вирин–Диприон» в нашей стране прекратилось, а потребность в биологических средствах защиты ежегодно растет, в 2011 году, в лаборатории биологических методов защиты леса ВНИИЛМа были возобновлены исследования по разработке нового препарата на основе вируса ядерного полиэдроза рыжего соснового пилильщика. В результате был отобран штамм-продуцент, проведено его депонирование в Государственную коллекцию вирусов. Одновременно была разработана технология малотоннажного производства вирусного препарата и проведены работы по созданию и запуску лабораторного производства для выпуска эталона вирусного препарата. В 2014 годуна базе филиала ФБУ ВНИИЛМ «Южно-европейская НИЛОС» начала действовать лаборатория по производству эталона вируса ядерного полиэдроза против рыжего соснового пилильщика. Перед сотрудниками нашей лаборатории поставлена задача наработки эталона вируса, наиболее эффективно поражающего рыжего соснового пилильщика.

Как известно,  вирус  ядерного  полиэдроза может размножаться только в клетках живых ложногусениц. Поэтому для накопления вирусной биомассы в Вешенском участковом лесничестве (Шолоховское лесничество, Ростовская область), в течение трех дней, срезались ветви сосны обыкновенной, пораженные личинками рыжего соснового пилильщика. В условиях лаборатории было заложено два варианта опытов. В первом варианте ветви с ложногусеницами 1-2 возраста поместили в ведра с водой, оставили для доращивания, используя для подкорма свежесрезанные ветви. По достижению личинками  5-6 возраста провели обработку вирусным препаратом, полученным  в лаборатории ВНИИЛМа из биомассы, наработанной в 2014г. Титр вирусной суспензии, приготовленной для обработки, составил 2*106 полиэдров в 1 мл. Первые погибшие ложногусеницы появились на 5 сутки, 100% гибель зараженных личинок наступила на 10 сутки. В помещении вели мониторинг среднесуточных температур.  Для второго варианта свежесрезанные ветви, пораженные личинками  рыжего соснового пилильщика 2-3 возраста поместили в изолированное помещение, ветви оставили без воды, обработали вирусной суспензией с таким же количеством полиэдров вируса в 1 мл. Гибель 100% ложногусениц наступила на 8 сутки. Для данного варианта опыта так же проводили наблюдения за показателями температуры воздуха в помещении. Гибель ложногусениц при равном титре вирусной суспензии в разные сроки объясняется разным возрастом зараженных ложногусениц и разным температурным режимом в помещении (В первом варианте опыта показатели температуры колебались в границах от +160С до +25 0 С, во втором – от +180 С до +270 С). Полученные результаты сравнивались с экспериментальными данными С.А. Бахвалова [6] при тестировании  препарата «Вирин–Диприон» и отражены в таблице 1.

На основании сравнительного анализа, проведенного нами, можно сделать вывод о высокой вирулентности препарата, полученного в лабораторных условиях.

 

Таблица 1 - Динамика смертности личинок рыжего соснового пилильщика, инфицированного вирусом ядерного полиэдроза

№№п/п

Наименование

Возраст обрабатываемых ложногусениц

Титр вирусной суспензии, полиэдров/мл

Смертность ложногусениц, сутки

Процент смертности

11

I вариант

5-6

2*106

10

100%

22

II вариант

2-3

2*106

8

100%

33

Обработка «Вирин-Диприоном» 1

1-2

1*109

8-9

90%

44

Обработка «Вирин-Диприоном» 2

2-3

1*109

13-14

90%

 

В ходе наблюдения за  зараженными ложногусеницами в лабораторных условиях в прошлом  году  было  установлено их массовое  перемещение  с веток  на солнцезащитную фольгу, которая случайно оказалась рядом с зараженными  личинками на ветках.  В этом году решили проверить закономерность поведения   зараженных личинок рыжего соснового пилильщика в опыте с фольгой.  В помещении,  с зараженными гусеницами,   вдоль окна расстелили алюминиевую фольгу таким образом, чтобы  солнечный свет падал на эти листы. Личинки начали  интенсивное перемещение на  фольгу. Через определенное  время  всех личинок на фольге  собрали и переместили на  белую ткань. Через некоторое время ложногусеницы с ткани снова переползли на фольгу. Большое количество личинок расползлось и на белые кафельные стены помещения. Зная коэффициент отражения белого кафеля (0,6-0,75) и пищевой алюминиевой фольги (около 0,7-0,9), можно предположить, что поведение личинок объясняется явлением положительного фототаксиса [7], когда солнечные лучи играют роль своеобразного «компаса». Насекомые перемещаются в нашем случае не на тепло, а  на свет. Это поведение ложногусениц можно использовать для уменьшения себестоимости технологического процесса производства жидкого вирусного препарата, так как затраты на очистку и сбор материала сокращаются по нашим данным  на 10-15%.

Для сбора мертвых ложногусениц и очистки их от экскрементов и хвои использовались пинцеты и сито. Этот этап производства препарата является наиболее трудоемким, так как требует применения ручного труда  достаточно продолжительное  время.  Собранные ложногусеницы просушивались в тени, на ткани, потом взвешивались.  Общий вес сухих насекомых составил 139,28гр., масса коконов 74,14 гр.,   или в процентном отношении  65% - ложногусеницы, 35% - коконы  (коконы не используются в производстве вирусного препарата).  Сопоставляя процентное соотношение  массы сухих насекомых к массе коконов,  получившихся в результате  заражения   гусениц в разных возрастах развития оказалось, что  для  получения  большего количества вирусной биомассы,  эффективнее заражать  ложногусениц младших возрастов. В  нашем   случае  более высокие показатели получены при заражении личинок 2-3 возраста, коконов 27%, при заражении  личинок пятого возраста, коконов  40 %.  

Особое внимание в процессе проводимого опыта  уделялось температуре воздуха в помещении с зараженными ложногусеницами.   Установлено, что гибель насекомых начинается гораздо раньше при  температуре  от  +250С до +270 С. К такому же выводу пришли  в своих исследованиях  Гулий В.В и Голосова М.А [4].

Для определения затрат,  весь технологический  процесс  получения исходного биоматериала  был  разделен на   отдельные  операции.   Для каждого  вида работ устанавливались  временные затраты её выполнения, учитывалась оплата труда персонала, участвующего в этих операциях,  затраты  на используемое сырьё, материалы  и инвентарь необходимые для   ведения работ.  Наименование  операций, временные  и  финансовые затраты на выполнение  каждой операции  представлены в таблице 2.

 

Таблица 2-  Операции технологического процесса по сбору  исходного  биоматериала, финансовые и временные  затраты их выполнения

Шифр

Наименование  операций

Количество человек, участвующих в операции,  чел.

Временные затраты на выполнение операции, час

Финансовые затраты на выполнение операции, руб.

Соотношение временных и финансовых затрат  по отношению к общим затратам, %

 1.

Выезд в насаждения, подбор участков насаждений, зараженных  гусеницами РСП

3 (три выезда, по три человека, один час)

9,0

857

10/9

2.

Срезка  веток, пораженных гусеницами РСП и сбор их в мешки

3 (Три раза по два часа, три человека)

18,0

1714

19/18

3.

Извлечение веток из мешков и раскладка их по ведрам с водой

2 (2 человека, три раза по 20 минут)

2,0

210

2/2

4.

Инфицирование здоровых  ложногусениц

2 (по 0,3 часа каждый человек)

0,6

63

1/1

5.

Заготовка корма  (веток с хвоей) для ложногусениц

1 (4 раза по 1 часу)

4,0

359

4/4

6.

Кормление зараженных ложногусениц

1 (5 раз по 16 минут)

1,3

135

1/1

7.

 Сбор погибших ложногусениц

2 (по 29 часов каждый сотрудник)

58,0

6102

63/65

ИТОГО:

 

92,9

9440

100/100

 

Полученные данные показывают, что 63% временных и 65 % финансовых средств затрачено на сбор погибших ложногусениц с веток, к которым они присохли и  которых по одной личинке  приходилось снимать со стволика ветки и отделять от хвои. В эту операцию включались затраты и на сбор  осыпавших с веток личинок, отделяя их от экскрементов и хвои. Вторая по  величине затратности операция включала такие виды работ как срезка  веток, пораженных гусеницами рыжего соснового пилильщика и сбор их в мешки. В два раза меньше затрат ушло на первую операцию по сравнению со второй. Затраты  на остальные операции  изменялись в денежном выражении от 63 до 359 рублей.  Затраты на весь технологический процесс  выполнения работ по сбору исходного биоматериала  составили 10117 рублей,  с учетом используемого сырья,   материалов, инвентаря, затрат на амортизацию автомашины и оборудования, затрат на электроэнергию. Соотношение затрат показано на рисунке 1.

 

Рисунок 1 – Соотношение затрат при сборе исходного сухого биоматериала  для производства вирусного препарата

 

  Исходя из того, что в результате понесенных затрат было собрано 139,28 грамм  исходного биоматериала, стоимость  одного грамма заготовки  составила  в денежном выражении 72 рубля 64 копейки. И это только часть затрат,  затрат первого этапа  в производстве  эталона  вирусного препарата, но столь необходимая для начала работ по производству отечественного биопрепарата против рыжего соснового пилильщика. 

 

Список использованных источников

1.    Escherich K. Neues uber Polyederkrenkheiten// Naturv.  Z. Lend –u.  Forstwirtsch.  -1913.  – N. 11 . – S. 86-97

2.    Бондаренко Н.В. Биологическая защита растений. – М.:Агропромиздат, 1986. – 280 с.

3.    Орловская Е.В. Вирусы насекомых и их применение в  защите растений. – М.: ВНИИ инф-ции и техн.-экон. исследов. по  сельск. хоз-ву. МСХ СССР, 1970. – 41 с.

4.    Гулий В.В., Голосова М.А. Вирусы в защите леса от вредных насекомых. – М., 1975 – 167с.

5.    Максимова Ю.В. Биологические методы защиты леса.  – Томск, 2014. – 172с.

6.    Бахвалов С.А. Влияние взаимоотношений в системе растение – насекомое – паразит на развитие и популяционную динамику насекомых: Автореф. Дис. доктора биологических наук – Новосибирск, 2008. – 42с.

7.    Яхонтов В.В. Экология насекомых –М., 1964. –457с.